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Como consecuencia de los concursos públicos
realizados a mitad de año para la adquisición de reactivos para determinar la carga
viral VIH-1, la técnica que más se está utilizando en nuestro país es la RT-PCR, por
lo que damos una descripción de las características principales de esta técnica.
Según podemos leer en sus especificaciones
técnicas 'AMPLICOR MONITOR para VIH-1 es una prueba de amplificación in vitro de
ácidos nucleicos para la cuantificación del ARN del VIH-1 en plasma humano. Esta prueba
puede utilizarse, junto a los datos clínicos y otros marcadores analíticos, como un
indicador del pronóstico de la enfermedad.'
La técnica se realiza en una serie de
pasos:
Preparación de las
muestras: mediante una mezcla lítica se aísla el ARN
presente en el plasma y se precipita. En esta fase se introduce, junto al reactivo de
lisis, un número conocido de moléculas de ARN (PC o IQS) que sirven como patrón para la
cuantificación (por ejemplo, 71 copias). Este PC es una molécula no infecciosa de ARN,
transcrita in vitro, con 219 pares de bases y regiones de fijación a los iniciadores
idénticas a la de la secuencia diana del VIH-1. Da lugar a un producto con 142 bases
idéntico en bases al del VIH-1 pero cuya región de fijación a las sondas es diferente,
lo que permite diferenciar entre los productos del PC y los productos diana del VIH-1
Amplificación por PCR y amplificación selectiva del ADNc. Por sucesivos ciclos de
calentamiento (termociclados) se desnaturalizan el híbrido de ARN y ADNc Tras el primer
ciclo, cuando se enfría la mezcla, el iniciador se hibrida con la hebra de ADNc, sufre la
elongación por la polimerasa y se sintetiza así una segunda hebra de ADN. Por lo tanto
se ha obtenido una copia bicatenaria de ADNc de la región diana de cada ARN del VIH-1 o
del PC. Un nuevo proceso de calentamiento separa el ADN bicatenario y expone la secuencia
diana a los iniciadores, que al enfriarse, se hibridan con el ADN diana y la rTth elonga
los iniciadores hibridados a lo largo del bloque diana sintetizando una nueva molécula
bicatenaria de 142 pares de bases que se llama amplicón. En sucesivas repeticiones del
proceso tiene lugar la duplicación cada vez de la cantidad de amplicón.
El empleo de AmpErase® y trifosfato de desoxiuridina permiten amplificar selectivamente
el ADNc ya que los amplicones con desoxiuridina son destruidos antes de iniciar la
amplificación del ADN diana (el ADN natural no tiene desoxiuridina, por lo tanto los
existentes son contaminantes; al ser inactiva a más de 55 grados no destruye los
amplicones diana que se obtiene en los sucesivos pasos de la amplificación).
Hibridación de los productos amplificados con sondas oligonucleotídicas
específicas. Los amplicones del VIH-1 y del PC se desnaturalizan químicamente a ADN
monocatenario mediante una solución de desnaturalización y se pasan a una placa de EIA
con pocillos cubiertos por sondas oligonucleotídicas específicas para el VIH-1 (SK102) y
el PC (CP35). Los amplicones del VIH-1 y PC se unen en los pocillos mediante hibridación
con las sondas. En la placa se ponen diluciones seriadas (factor de dilución :1, 5, 25,
125, 625 y 3125) de los amplicones desnaturalizados para lo que consideraremos muestra y
para el PC (factor de dilución: 1 y 5). (El factor de dilución 1 corresponden a 100
microlitros de tampón de hibridación y 25 microlitros de amplicón desnaturalizado; a
partir de él se hacen las diluciones seriadas en la misma microplaca hasta la fila F; lo
mismo para el PC en las filas G y H).
Detección: Después de la hibridación en la microplaca, ésta se lava para
eliminar el material no fijado y se continua como cualquier otro EIA : añadir conjugado,
lavar, incubar, lavar, añadir substrato TMB, incubar, frenar y leer a 450 nm. El grado de
color, densidad óptica (DO), de cada pocillo es proporcional a la cantidad de amplicón
presente. El número de copias se obtiene aplicando una fórmula: cociente entre la DO
total para el VIH-1 y DO total para el PC, multiplicado por el número de moléculas del
PC introducido. (se multiplica también por 40 que es un factor de conversión de copias
de PCR a copias por mililitro de plasma).
Se espera que las DO obtenidas, en el caso
de existir copias de ARN, sigan una relación lineal: menor DO a mayor factor de
dilución. Para los amplicones desnaturalizados hibridados como muestra se deben desechar
todos los valores de DO menores de 0,200 y mayores de 2,000; para los amplicones
hibridados como PC se desechan los valores menores de 0,300 y mayores de 2.000 (si ninguna
de las diluciones del PC lo cumple el resultado no es válido).
Cuando todos los valores de DO para amplicones de muestras son inferiores a 0,200 pero los
valores de DO del PC son correctos se considera que la muestra cumple las condiciones al
factor de dilución 1 y a la DO de 0,200.
Cuando todos los valores de DO para amplicones de muestras son superiores a 2,000 pero los
valores de DO del PC son correctos se considera que la muestra tiene más de 750.000
copias/ml y se debe probar con una dilución 1:25 de la muestra original.
Cuando la DO para los pocillos de los amplicones de la muestra no sigue un orden
descendente puede existir un error y se deben verificar las condiciones especificas para
saber si el resultado es o no interpretable. Si ocurre lo mismo con los amplicones del PC
el resultado no es válido debido a un error.
Los valores de los controles negativo, positivo débil y positivo alto deben estar dentro
de los valores indicados para cada equipo.
La prueba NASBA (Nucleic Acid
Sequence-Based Amplification) se fundamenta en un amplificación basada en la
transcripción y una detección basada en un método de electroquimioluminiscencia. Cada
muestra se procesa con tres controles o calibradores internos presentes a concentraciones
diferentes (100, 10 y 1) que se diferencian entre si y del ARN amplificado del VIH en 20
nucleótidos. La reacción de RT se lleva a cabo sobre la muestra y los calibradores
mezclados, dando lugar a ADN de doble cadena; toda la amplificación se realiza a una
misma temperatura (isoterma) y uno de los iniciadores contiene una zona promotora
necesaria para la actuación de la ARN-polimerasa T7 que sintetiza ARN a partir de ADNc.
La detección se basa en la emisión de luz por parte de átomos de rutenio unidos al ARN
amplificado, que se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la
emisión de los calibradores.
En el bDNA (branched DNA o ADN ramificado)
el material inicial son los viriones y no el ARN plasmático total. A diferencia de las
anteriores no utiliza controles internos para cada muestra sino que se emplean para todas
las muestras procesadas a la vez. El ácido nucleico extraído se fija en una microplaca
que contiene sondas específicas y, sobre el ARN que se une, se fijan sondas de ADN con 15
ramificaciones, a cada una de las cuales se unen 3 sondas marcadas capaces de emitir luz
al añadir un sustrato. Por cada molécula de ARN se unen cerca de 1.800 moléculas
emisoras de luz y los datos se interpretan en función de las lecturas de los controles,
cuya concentración es conocida. Las muestras se procesan por duplicado; si sus resultados
tienen un coeficiente de variación mayor del 30% se desecha el resultado.
Mientras que bDNA y RT-PCR sólo se hacen
con plasma, NASBA puede realizarse con plasma, suero, sangre total, semen, orina o
líquido cefalorraquídeo. Existen variantes de todas las pruebas, en versiones mejoradas,
que tienen mayor sensibilidad, es decir son capaces de detectar un menor número de
copias/ml.
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